权阳生物设计的Human Genome siRNA Library,覆盖整个人类基因组的2万多个基因,大大加速了siRNA药物筛选及对疾病机理的研究,特别针对人类重要基因分类设计了近170个 siRNA子文库,信号通路、细胞凋亡、包括激酶、GPCR、离子通道、细胞增殖、磷酸酯酶、核受体相关等。这些文库中每个基因3对siRNA,分别针对 该基因的三个不同靶点,保证了较好的基因沉默效果。
如果您无需预设计的siRNA文库,您可以选择其中的几十个基因进行定制个性化siRNA文库,订购详情请见订购须知。
siRNA 转染 | |||
A.siRNA转染的方法 | |||
脂质体型转染试剂进行转染需要注重的几点 | |||
哺乳动物转染的常见方法有:磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、机械法(例如,显微注射和基因枪)、阳离子脂质体试剂,其中阳离子脂质体试剂转染法是目前最常用的转染方法。 |
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B.Lipofectamin2000 转染试剂 | |||
Lipofectamin2000的应用领域 | |||
选择最适合的转染试剂和转染条件,往往取决于不同的哺乳动物细胞类型和不同的核酸分子。 Lipofectamin2000适用于核酸的体内和体外操作,可应用于DNA、RNA、反义寡核苷酸、siRNA的转染,也可应用于DNA/siRNA 的共转染操作;是一种新型的高效siRNA转染试剂。 |
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Lipofectamin2000 的特点: | |||
不必更换培养基,操作简便易行,可在半小时内完成操作 | |||
在含血清培养基中也能表现高转染效率 | |||
细胞毒性低;适用细胞广泛 | |||
即用型试剂,可在含有抗生素的完全培养基中转染 | |||
基于脂质的转染试剂,确保没有RNAse活性 | |||
□ 可介导siRNA高转染细胞及体内siRNA的高效导入 | |||
C.Lipofectamin2000适用的细胞类型 | |||
Lipofectamin2000转染试剂可广泛应用于多种细胞系的DNA和siRNA转染如: HeLa(人颈部癌 细胞)、MCF-7(人乳房癌细胞)、Hep3B(人肝细胞癌细胞)、COS-7(猴肾细胞)、Neuro-2a(鼠神经母细胞瘤细胞)、NIKS(人角 质化细胞)、B16(鼠黑素瘤细胞)、DLD-1(人结肠癌细胞)、NIH/3T3(鼠胚胎成纤维细胞)、HT-29(人结肠腺癌细胞)、A549(人肺 癌细胞)、CHO-k1(仓鼠卵巢细胞)和293(腺病毒5 DNA转化的人胚胎肾细胞),SVRbag4细胞等。 |
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D.转染前细胞培养 | ||||||||||
在细胞板上培养细胞时,应使细胞汇合在24小时内达到70-90%。 | ||||||||||
细胞培养用品 | 表面积(mm2/孔) | 细胞密度 | 培养基(μL /孔) | |||||||
96孔板 | 50 | 1.5´104-5.0´104 | 100μL | |||||||
48孔板 | 100 | 3.0´104-1.0´105 | 200μL | |||||||
24孔板 | 200 | 8.0´104-2.0´105 | 500μL | |||||||
12孔板 | 401 | 1.6´105-4.0´105 | 1.0 mL | |||||||
6孔板 | 962 | 3.0´105-8.0´105 | 2.0 mL | |||||||
35 mm | 962 | 3.0´105-8.0´105 | 2.0 mL | |||||||
60 mm | 2827 | 1.0´106-2.5´106 | 6.0 mL | |||||||
E.合适的lipofectamin2000用量 | ||||||||||
合适的siRNA(DNA):lipofetamin2000比例对核酸的高效转染有重要影响;我们推荐的 DNA:lipofetamin2000为1:0.5—1:5(ug:ul),siRNA:lipofectamin2000为 1:0.01-1:0.1(pmol:ul)一般情况下,此范围内都可获得高的转染效率。 | ||||||||||
细胞培养用品 | siRNA/DNA | 培养基最终体积 | Lipofectamin2000(siRNA/DNA) | |||||||
96孔板 | 5pmol/0.2μg | 100μL | 0.25μl/0.5μl | |||||||
24孔板 | 20pmol/0.8μg | 500μL | 1μl /2μl | |||||||
12孔板 | 40 pmol /1.6μg | 1 mL | 2μl /4μl | |||||||
6孔板 | 100 pmol /4.0μg | 2 mL | 5μl /10μl | |||||||
35 mm | 100 pmol /4.0μg | 2 mL | 5μl /10μl | |||||||
60 mm | 600 pmol /8.0μg | 5 mL | 10μl /20μl |
F.贴壁细胞转染程序 | ||
转染前一天,4-5´104细胞接种在24孔板上, 0.5mL含FBS和抗生素的DMEM(或Opti-MEM,其他培养基)细胞培养基。 | ||
选用生理状态良好的细胞对提高转染效率很 | 2. 选择用于初期接种的细胞数量,应能在24小时内使细胞汇合达到70-90%。 | |
重要。siRNA(DNA)和lipofectamin的用量和两者的比例可在推荐范围内适当调整。 | ||
在50μl的DMEM(或Opti-MEM,或其他无血清培养基)无血清培养基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA),柔和混匀; | ||
混匀lipofectamin试剂,用50μl无血清的DMEM或Opti-MEM,或其他无血清培养基)稀释1μl lipofectamin试剂(DNA转染时,则加入2μllipofectamin试剂),轻轻混匀,室温放置5分钟; | ||
将稀释好的siRNA和RNAi-Mate试剂混合;轻柔混匀,室温放置20分钟,以便形成siRNA/lipofectamin(或DNA/lipofectamin)复合物。 | ||
将100μl siRNA/lipofectamin(或DNA/lipofectamin)复合物加到含有细胞和培养基的培养板的孔中,来回轻柔摇晃细胞培养板板。 | ||
7. 细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后,进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感,孵育4-6小时后,除去复合物,更换培养基。 | ||
G.悬浮细胞转染程序 | ||
转染的当天,收集细胞离心,用含FBS的培养基重悬。 | ||
在50μl的DMEM(或Opti-MEM,或其他无血清培养基)无血清的培养基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA),柔和混匀; | ||
混匀lipofectamin试剂,用50μl无血清的DMEM或Opti-MEM,或其他无血清培养基)稀释1μl lipofectamin试剂(DNA转染时,则加入2μl lipofectamin试剂),轻轻混匀,室温放置5分钟; | ||
将稀释好的siRNA和lipofectamin试剂混合;轻柔混匀,室温放置20分钟,以便形成siRNA/lipofectamin(或DNA/lipofectamin)复合物。 | ||
再加入400μL细胞悬浮液(细胞数量决定于细胞类型和转染后分析测试的时间)。 | ||
6. 细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后,进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感,孵育4-6小时后,除去复合物,更换培养基。 | ||
H.DNA和siRNA共转染细胞 | ||
在转染的前一天,4-5´104细胞接种在24孔板上,0.5 mL含FBS和抗生素的细胞培养基。 | ||
选择用于初期接种的细胞密度,应能在24小时内使细胞汇合达到70-90%。 | ||
在100μL的无血清的培养基中稀释20pmol siRNA和0.2μg DNA,加入2μl lipofectamin试剂,充分混合,放置20分钟,以便形成siRNA/ DNA/lipofectamin复合物。 | ||
将siRNA/ DNA/lipofectamin复合物加入培养基中,轻轻混匀。 | ||
5. 细胞在37℃温育24h-48h后,进行转染后的其它步骤。 | ||
I.siRNA体内导入方法 | ||
适量的siRNA或DNA溶于不含RNA酶的无菌水中,轻轻混匀,因为注射液体积有限,建议采用高浓度的siRNA或DNA,一般DNA为2μg /μL、siRNA为10μg /μL。 | ||
取适量的DNA、siRNA或siRNA\DNA复合物与lipofectamin混合。例如,在1#管中加入0.5μL的DNA(1μg)和 0.5μL的siRNA(5μg),在2#管中加入0.55μL的lipofectamin(24μg)和0.45μL不含RNA酶的无菌水中,将1#管 中的溶液加入2#管中,在室温下温育30分钟,以形成siRNA/DNA-lipofectamin复合物。 | ||
3. 制备的siRNA/DNA-lipofectamine复合物可用于体内导入siRNA、DNA或siRNA\DNA。 |
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