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                                                                                               普通siRNA合成
产品简介

普通的siRNA oligo均由HPLC纯化，100％除去尚未配对的单链，价格便宜，质量上乘。研究者只需用包装盒内的通用缓冲溶液稀释后即可用e转染试剂进行后续实验。

实验方法

siRNA 转染  
A．siRNA转染的方法  
  脂质体型转染试剂进行转染需要注重的几点
哺乳动物转染的常见方法有：磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、机械法（例如,显微注射和基因枪）、阳离子脂质体试剂，其中阳离子脂质体试剂转染法是目前最常用的转染方法。
  • 转染试剂的用量
  • siRNA的用量 
  • 转染时的细胞密度
  • 转染时的操作顺序 
  • 转染时的操作顺序 
 
  • 细胞与转染试剂/siRNA复合物的温浴的时间
B．Lipofectamin2000 转染试剂  
  Lipofectamin2000的应用领域
选择最适合的转染试剂和转染条件，往往取决于不同的哺乳动物细胞类型和不同的核酸分子。 Lipofectamin2000适用于核酸的体内和体外操作，可应用于DNA、RNA、反义寡核苷酸、siRNA的转染，也可应用于DNA/siRNA 的共转染操作；是一种新型的高效siRNA转染试剂。
  • 原代培养细胞和转化细胞株的基因转染
 
 
  • siRNA高通量转染试验
 
 
 
  • DNA转染；DNA和siRNA的共转染
 
 
 
  • 核酸（siRNA、DNA、RNA）的体内导入试验
 
 
 
  • 贴壁细胞和悬浮细胞转染
   
  Lipofectamin2000 的特点：
  不必更换培养基，操作简便易行，可在半小时内完成操作
  在含血清培养基中也能表现高转染效率
  细胞毒性低；适用细胞广泛
  即用型试剂，可在含有抗生素的完全培养基中转染
  基于脂质的转染试剂，确保没有RNAse活性
  □ 可介导siRNA高转染细胞及体内siRNA的高效导入
C．Lipofectamin2000适用的细胞类型   
Lipofectamin2000转染试剂可广泛应用于多种细胞系的DNA和siRNA转染如：

HeLa(人颈部癌 细胞)、MCF-7(人乳房癌细胞)、Hep3B(人肝细胞癌细胞)、COS-7(猴肾细胞)、Neuro-2a(鼠神经母细胞瘤细胞)、NIKS(人角 质化细胞)、B16(鼠黑素瘤细胞)、DLD-1(人结肠癌细胞)、NIH/3T3(鼠胚胎成纤维细胞)、HT-29(人结肠腺癌细胞)、A549(人肺 癌细胞)、CHO-k1(仓鼠卵巢细胞)和293(腺病毒5 DNA转化的人胚胎肾细胞),SVRbag4细胞等。
       


D．转染前细胞培养  
  在细胞板上培养细胞时，应使细胞汇合在24小时内达到70-90%。
  细胞培养用品 表面积（mm2/孔） 细胞密度 培养基（μL /孔）  
  96孔板 50 1.5´104-5.0´104 100μL  
  48孔板 100 3.0´104-1.0´105 200μL  
  24孔板 200 8.0´104-2.0´105 500μL  
  12孔板 401 1.6´105-4.0´105 1.0 mL  
  6孔板 962 3.0´105-8.0´105 2.0 mL  
  35 mm 962 3.0´105-8.0´105 2.0 mL  
  60 mm 2827 1.0´106-2.5´106 6.0 mL  
E．合适的lipofectamin2000用量  
  合适的siRNA(DNA)：lipofetamin2000比例对核酸的高效转染有重要影响；我们推荐的 DNA：lipofetamin2000为1：0.5—1：5（ug:ul），siRNA：lipofectamin2000为 1：0.01-1：0.1（pmol：ul）一般情况下，此范围内都可获得高的转染效率。
细胞培养用品 siRNA/DNA 培养基最终体积 Lipofectamin2000(siRNA/DNA)  
96孔板 5pmol/0.2μg 100μL 0.25μl/0.5μl  
24孔板 20pmol/0.8μg 500μL 1μl /2μl  
12孔板 40 pmol /1.6μg 1 mL 2μl /4μl  
6孔板 100 pmol /4.0μg 2 mL 5μl /10μl  
35 mm 100 pmol /4.0μg 2 mL 5μl /10μl  
60 mm 600 pmol /8.0μg 5 mL 10μl /20μl  
F．贴壁细胞转染程序     
  转染前一天，4-5´104细胞接种在24孔板上， 0.5mL含FBS和抗生素的DMEM（或Opti-MEM，其他培养基）细胞培养基。  
 
  
选用生理状态良好的细胞对提高转染效率很 2． 选择用于初期接种的细胞数量，应能在24小时内使细胞汇合达到70-90%。  
重要。siRNA(DNA)和lipofectamin的用量和两者的比例可在推荐范围内适当调整。  
  在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他无血清培养基）无血清培养基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA)，柔和混匀；  
   
    
  混匀lipofectamin试剂，用50μl无血清的DMEM或Opti-MEM，或其他无血清培养基）稀释1μl lipofectamin试剂（DNA转染时，则加入2μllipofectamin试剂），轻轻混匀，室温放置5分钟；  
 
  
  将稀释好的siRNA和RNAi-Mate试剂混合；轻柔混匀，室温放置20分钟,以便形成siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）复合物。  
 
  
  将100μl siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）复合物加到含有细胞和培养基的培养板的孔中，来回轻柔摇晃细胞培养板板。  
 
  
  7． 细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后，进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感，孵育4-6小时后，除去复合物，更换培养基。    
G．悬浮细胞转染程序     
  转染的当天，收集细胞离心，用含FBS的培养基重悬。  
 
  
  在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他无血清培养基）无血清的培养基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA)，柔和混匀；  
 
  
  混匀lipofectamin试剂，用50μl无血清的DMEM或Opti-MEM，或其他无血清培养基）稀释1μl lipofectamin试剂（DNA转染时，则加入2μl lipofectamin试剂），轻轻混匀，室温放置5分钟；  
 
  
  将稀释好的siRNA和lipofectamin试剂混合；轻柔混匀，室温放置20分钟,以便形成siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）复合物。  
 
  
  再加入400μL细胞悬浮液（细胞数量决定于细胞类型和转染后分析测试的时间）。  
 
  
  6． 细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后，进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感，孵育4-6小时后，除去复合物，更换培养基。    
     
     
     
     
     
H．DNA和siRNA共转染细胞  
  在转染的前一天，4-5´104细胞接种在24孔板上，0.5 mL含FBS和抗生素的细胞培养基。
  选择用于初期接种的细胞密度，应能在24小时内使细胞汇合达到70-90%。
  在100μL的无血清的培养基中稀释20pmol siRNA和0.2μg DNA，加入2μl lipofectamin试剂，充分混合，放置20分钟,以便形成siRNA/ DNA/lipofectamin复合物。
  将siRNA/ DNA/lipofectamin复合物加入培养基中，轻轻混匀。
  5． 细胞在37℃温育24h-48h后，进行转染后的其它步骤。
I．siRNA体内导入方法  
  适量的siRNA或DNA溶于不含RNA酶的无菌水中，轻轻混匀，因为注射液体积有限，建议采用高浓度的siRNA或DNA，一般DNA为2μg /μL、siRNA为10μg /μL。
  取适量的DNA、siRNA或siRNA\DNA复合物与lipofectamin混合。例如，在1#管中加入0.5μL的DNA（1μg）和 0.5μL的siRNA（5μg），在2#管中加入0.55μL的lipofectamin（24μg）和0.45μL不含RNA酶的无菌水中，将1#管 中的溶液加入2#管中，在室温下温育30分钟，以形成siRNA/DNA-lipofectamin复合物。
  3． 制备的siRNA/DNA-lipofectamine复合物可用于体内导入siRNA、DNA或siRNA\DNA。

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