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TSB慢病毒包装试剂盒使用说明
发布日期:2016-05-27 13:35:40 浏览次数 :
导读
TSB慢病毒包装试剂盒使用说明
 
 
  • 实验流程
 
制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒,三种质粒载体分别进行高
纯度无内毒素抽提,共转染 293T 细胞,转染后 6 h 更换为完全培养基,培养 48和 72h 后,分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
 
二、实验材料
 
(一)慢病毒载体、包装细胞和菌株
该病毒包装系统为三质粒系统,组成为 pspax2, pMD2G, pLVX \ pCDH\pLKO\pTSB

  1. 表达载体信息
权阳生物所使用的慢病毒载体多为 SBI的 pLVX系列载体和 clotech的pCDH系列载体为基础,加以改造并验证的pTSB系列载体。

2) 包装质粒信息如下:
   我司的慢病毒表达质粒使用2代及3代包装系统均可,推荐一下两种包装体系:
第二代包装质粒:
PSPAX2 及PSPAX2载体图谱和序列信息
质粒配比:
packing mix:PSPAX2:PSPAX2  3:1
     包装体系:packing mix:pTSBLV 
 
第三代包装质粒:
PLP1,PLP2 和 pCMV -VSVG。
质粒配比:
packing mix:PLP1(3):PLP2  (2):pVSVG
     包装体系:packing mix:pTSBLV  1:2
 
(二)细胞株293T,慢病毒的包装细胞,为贴壁依赖型成上皮样细胞,生长培养基为 DMEM(含 10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
 
(三)菌株大肠杆菌菌株 DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
 
三、包装细胞 293T 细胞的培养
 
(一)293T细胞的冻存
 
随着传代的次数增加,293T细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止
此类现象的出现,我们需要在开始就对细胞进行大量冻存,以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存,增加细胞复苏成活率。
 
  1. 去掉上清液,加入PBS洗去残留的培养基;
 
2、加入0.25%的胰酶,消化1~2min后,镜下观察细胞变圆,细胞间间隙加
大时,去除胰酶,加入新鲜培养基吹打混匀,移入离心管中。
 
3、细胞计数,将细胞全部晃下,加入3mL 37 ℃ 预热的10%DMEM,用10mL 移液管进行吹打,较大力吹打6-8 次即可,不留死角,之后,将所有细胞吸出,置于15mL 离心管中,取50ul 混匀后的细胞于1.5mL eppendorf 管中,加入450ul 10%DMEM,即为10 倍稀释,混匀,取10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共4 大格,每大格16 小格。计数时,4 大格均计 数,总数除以4(得每大格细胞数),再乘以10(10 倍稀释),即 为实际n万/mL 细胞浓度。
 
4、细胞离心,1000rpm,5min。去掉上清。
 
5、根据细胞计数结果加入细胞冻存液(70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO),重悬细胞,密度为3 x 106个/ml。
 
6、分装进细胞冻存管,放入冻存盒中,放入-80℃超低温冰箱。
 
7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存,并作记录。保存过程中,要不时复苏细胞检测细胞存活率,观察细胞状态等。
 
(二)293T细胞的传代
 
当细胞生长到汇合率达到80%~90%时需要对细胞进行传代操作,以扩大细胞数量,维持细胞良好的生长状态。
 
  1. 消化细胞,方法同细胞冻存。
 
  1. 细胞离心结束后,加入完全培养基重悬。
 
3、根据具体情况,将细胞分到10cm培养皿中,每个培养皿补足到10ml培
养基。
 
  1. 将培养皿平稳放回37℃、5%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
 
(三)293T细胞的复苏
 
当细胞传代次数过多,细胞状态变差时,或者细胞出现污染事故时,需要丢
弃并对最初冻存的细胞进行复苏。
 
  1. 设置温度为37~42℃的水浴。
 
2、查看细胞库记录,根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞(需戴上棉手套,
防止被冻伤),迅速丢入水浴锅中并快速晃动,尽量在1~2min内使细胞溶液完全
溶解。
 
3、将细胞溶液转移到15ml离心管中,并在其中加上1ml新鲜的完全培
基,混匀后离心,1000rpm,5min。
 
4、去掉上清,加入5ml新鲜的完全培养基,混匀沉淀后,转入6cm培养皿。
将培养皿平稳放入37℃、5% CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。第二天观察细胞存活率。给细胞换一下培养基。以后每天观察细胞生长情况。
 
四、慢病毒包装和浓缩
 
  • 质粒扩增
 
构建好的慢病毒载体和辅助质粒需经过大量抽提,浓度大于1ug/ul,A260/280 在 1.7-1.8 间方可用以包毒。推荐使用 Qiagen 大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提。
 
  • 传 293T 细胞
 
将培养 293T 细胞 T75 瓶中的培养基吸净,加入 2mL 4 度冰箱取出的 0.25%
胰酶,使其均匀覆盖瓶底,置于 37 度培养箱中 3-5min,取出,摇晃可发现细胞于底部脱离,将其全部晃下,加入 3mL 37 度水浴中预热的 10% DMEM,移液枪用 10mL 移液管进行吹打,较大力吹打 6-8 次即可,不留死角,瓶口处较难吹打可将移液管对准培口,小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后,将所有细胞吸出,置于 15mL 离心管中,取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf管中,加入 450ul 10% DMEM,即为 10 倍稀释,混匀,取 10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共 4 大格,每大格 16 小格。计数时,4 大格均计数,总数除以 4(得每大格细胞数),再乘以 10(10 倍稀释),即为实际 n 万/mL 细胞浓度。传代当天记为第一天,若第二天进行转染,铺 900-1000 万/T75;若第三天转染,铺 350-400 万/T75。每瓶 T75 加 10mL 10%DMEM 培养基。转染当天观察细胞密度,80-90%满即可进行转染。转染前无需换培养基。
 
  • 做脂转 complex
 
Opti MEM 需在 37 度水浴中预热,Lipofiter
TM转染试剂需恢复至室温方可使
用,使用前需摇匀。
转染每瓶 T75 的 complex 成分如下:
pspax  10μg
PMD2G  10μg
pTSB系列载体  10μg
转染后 6h 换新鲜培液。
 
  • 病毒收集
 
转染后 48 和 72h 分别两次收集病毒上清(24h后置换新鲜培液),收集
后以 0.45 μm 滤器过滤,于 40 mL 超速离心管中,4℃,72000g/min 离心 120 分
钟;
  • 病毒重悬和保存
 
500ul 新鲜培养液重悬病毒沉淀,置于-80 度甚至液氮保存。
 
五、感染目的细胞
 
  • 细胞准备
 
将状态良好的目的细胞接种到 24 孔板,使细胞浓度为 1×105/ml 细胞,接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同,一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于 50%至 70%直接。
 
  • 病毒感染
 
  1. polybrene 的选择:
 
Polybrene:是带正电的小分子,与细胞表面的阴离子结合,提高慢病毒对细
胞的感染效率,通常加入 polybrene 能提高感染效率 2~10 倍。
Polybrene 有一定的细胞毒性,有的细胞对 polybrene 的毒理反应明显,因此细胞感染时是否适合 polybrene 需要摸索;不同细胞对 polybrene 的敏感度不同,可以用 1~10μg/ml 的范围筛选合适的浓度,以 24h 内细胞无明显毒性反应为佳,可参考文献并进行预实验摸索,polybrene 最常用的工作浓度为 6~8μg/ml。
 
2. 感染细胞最佳 MOI 的测定
 
MOI(Multiplicity of Infection,感染复数)是指每个细胞感染的病毒
数,通常 MOI 越高,病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。
对于分裂活跃的细胞,比如 Hela、293 细胞,MOI=1~3 时,80%以上的细胞均表达目的基因。而对于非分裂细胞,比如原代细胞,感染效率较低。需要进行 MOI梯度摸索实验,选择适合的 MOI 进行实验。
 
3.感染步骤
 
按实验需要将细胞铺板(比如 12 孔板)。细胞数以第 2 天密度约50%为宜。
37℃ 培养过夜。 对于 Polybrene 可施加的细胞:准备完全培养基和 Polybrene 混合物,Polybrene终浓度为摸索得到的最适终浓度。移去培养基并添加 0.5  ml Polybrene/培养基混合物于每孔中(适用于 24 孔板,其他孔板请相应调整体积。) 对于不适用 Polybrene 的细胞,以上步骤省略,直接进入下面步骤。感染前,从冰箱取出并在 37℃水浴中快速融化病毒,吸去细胞原有培养基,将病毒原液加入细胞中,轻轻 8 字混匀。(具体加入的病毒数可参考附表 1)感染后第二天(约 12 小时),吸去含病毒的培养液,换上新鲜的完全培养液,继续 37℃培养。感染后 48 小时,对于带 GFP 报告基因的病毒,可通过荧光显微镜观测 GFP表达效率,对于携带 Puromycin 抗性基因的病毒,换上含适当浓度的 Puromycin的新鲜完全培养液,筛选稳定转导的细胞株(详见下方)。
注意: 溶化的 shRNA 慢病毒颗粒置于冰上。反复冻溶或长时间将病毒颗粒暴露于常温可使病毒效价降低。
 
4.Puromycin 抗性筛选:
 
Puromycin 标准的施加终浓度范围为 1~10μg/ml,不同细胞 puromycin 的工作浓度不同,请查找相关文献(部分细胞参考用量见下图),另外请设不感染筛选对照(未经过病毒感染的野生型细胞),加入等量等浓度的 puromycin。
 
 
部分细胞 Species puromycin参考值
Cell line Puromycin(µg/ml)
293 Human 3
HeLa Human 3
B16 Mouse 1至3
PC1.0 Hamster 10
MC3T3-E1 Mouse 10
H9C2 Rat 1
MCF-7 Human 1至3
MDA-MB-××× Human 1至3
HepG2 Human 2
HT1080 Human 1
A549 Human 1.5
H1299 Human 2
 
更多Puromycin使用浓度更新中,详情请参考公司网站……
每 2-3 天换含 puromycin 的完全培养液一次,至不感染筛选对照组细胞被
puromycin 杀光,可进行以下两步操作(依照具体实验需要选择)。
不挑取单克隆:
将感染并筛选后的细胞进行传代,并继续施加 puromycin 进行维持性筛选培养。连续筛选并传 3 代后,冻存保重稳定细胞株。
挑取单克隆:
将感染并筛选后的细胞挑选至少 5 个克隆进行细胞扩增,,并继续施加 puromycin进行维持性筛选培养。扩增完毕后 western blot 或者 QPCR 检测目的蛋白的表达。挑取表达适中的稳定细胞株,连续筛选并传 3 代后,冻存保重稳定细胞株。
 
5. 感染悬浮细胞
 
上面介绍的是针对贴壁细胞的感染方法,若是悬浮或半悬浮细胞,则需要通
过平角离心转染法,即将适量的病毒液加入细胞培养皿后,封好口,放入平角离心机后,低速(500g-1000g/min)离心1h,然后放入培养箱中正常培养即可。若由于实验条件有限,没有平角离心机,可用离心管代替,将细胞吹打吸入离心管中,进行低速离心,去掉大部分上清,然后加入适量的病毒液,室温放置15min(不能超过半小时),然后将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿中继续病毒感染过夜后换液即可。
 
6. 对于极难感染的细胞
 
对于极难感染的细胞,如DC(树突状细胞)等,可采用多次感染的方法,
即感染24小时后,更换新鲜病毒进行二次感染,可显著提升感染效率。
 
 
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